一、摘要
砷（As）是一种广泛存在于全球水稻土壤中的有毒元素，其通过微生物过程被释放，对环境质量、食品安全和人类健康构成威胁。水稻根际是一个动态环境，其化学条件和微生物活性存在昼夜变化。然而，砷本身在这些日间周期中如何变化仍不为人所知。本研究在温室条件下开展宏转录组学与生物地球化学分析，以探究水稻根际中砷动态的昼夜节律。我们观察到亚硝酸盐(As(III))浓度在夜间呈现持续波动，从1.8升至2.9毫克/升；同时，亚铁离子(Fe(II))浓度上升了24.9%。夜间氧化还原电位降至约100毫伏，有利于砷/铁的还原反应。参与异养型砷/铁还原的关键功能菌属（如Geomobilimonas和Geobacter）的转录活性在夜间显著增强，表现为还原基因（arrA、omcS、omcZ和mtrC）的转录丰度升高，而相对丰度未发生相应变化。这些模式在田间试验中得到验证：在恒定黑暗条件下，上述昼夜变化模式消失。这些发现共同表明，通过将水稻种植与自然的日常周期相协调来管理，可能有助于降低污染风险并优化养分管理。
二、研究成果
1. 铁矿物还原引起的As(III)日变化
结果表明，水稻根际环境中三价砷(As(III))和二价铁(Fe(II))的浓度存在显著的日变化（图1）。土壤孔隙水中三价砷的平均浓度在夜间为2.9 mg·L⁻¹，而白天为1.8 mg·L⁻¹，夜间浓度比白天高出1.6倍（图1a）。二价铁的浓度也表现出类似趋势，夜间浓度（10.3至10.8 mg·L⁻¹）高于白天（8.2至8.6 mg·L⁻¹），增幅达24.9%。三价砷与二价铁浓度之间存在中等正相关关系（r = 0.76，P < 0.001），证实了二者在根际生物地球化学循环中的关联（图1c）。这些变化归因于夜间在低氧条件下铁矿物的还原溶解作用。
铁还原的临界电位（Eh）在接近中性的pH条件下约为300 mV，这与观测到的日变化Eh范围400–100 mV相符（图1a）。夜间Eh下降是由于光合作用停止，导致根系释放的氧气减少，同时呼吸作用消耗的氧气增加。白天，光合作用产生的氧气维持氧化环境，并促进根系分泌物的积累。夜间，由于缺乏氧气生成，且微生物呼吸消耗剩余氧气，形成低氧条件，有利于Fe(III)和As(V)的还原。这导致Eh在夜间降至100–200 mV（图1a），从而还原为As(III)，使孔隙水中As(III)浓度升高。Fe(III)矿物的还原性溶解会释放吸附的As(V)，随后As(V)被还原为As(III)，进一步提高夜间As(III)的浓度。土壤pH对As和Fe动态的影响较小，仅在日间pH 6.8至夜间pH 6.7之间出现轻微波动（接近中性pH范围）。此外，溶解性有机碳（DOC）浓度在夜间下降了18.2%，且与As(III)浓度无直接相关性（P > 0.05），表明DOC主要通过间接影响微生物呼吸作用而非直接的地球化学反应来影响砷的循环。这些结果表明，铁矿物的还原性溶解是根际环境中As(III)释放的主要驱动因素。
图1. 光暗循环下水稻根际的日变化
2. 砷/铁还原基因和分类群夜间上升
铁矿物的还原溶解不仅受根际理化条件的影响，还受功能基因活性的调控。已有研究证实，水稻土中存在多种砷生物转化相关基因。异化砷还原和铁还原基因的转录丰度被确定为日间砷(III)动态变化的关键驱动因素。这些基因表现出显著的日节律变化（图2a）。异化砷还原基因（arrA）以及铁还原基因（omcS、omcZ和mtrC）在夜间表现出明显增强的转录活性（图2b）。具体而言，arrA的转录丰度从白天的每百万条转录本0.39个上升至夜间的0.98个，而omcS、omcZ和mtrC的转录活性在夜间分别提高了2.2倍至4.0倍。
铁还原基因（omcS、omcZ和mtrC）的转录丰度和相对丰度均高于砷还原基因（图2a,b），表明铁还原基因在根际微生物中更为普遍。转录丰度（metaT）与相对丰度（metaG）之比可作为基因表达活性相对于基因丰度的指标，有助于区分真正的转录上调与因基因拷贝数增加导致的转录本丰度升高。异化铁还原基因（omcS、omcZ和 mtrC）的 metaT/metaG 比值大于1，表明其在夜间具有活跃的转录活动（图2c），说明铁还原的转录活性高于砷还原。有趣的是，arrA的 metaT/metaG 比值更高（比arsC 高1.6倍），凸显了其在低氧条件下促进砷(III)迁移的作用。尽管arsC的相对丰度和转录丰度高于 arrA，但其在细菌、古菌和真核生物中的更广泛分布可能解释了这一现象。夜间铁和砷还原基因的转录水平升高，与缺氧条件下砷(V)向砷(III)转化的同时增强直接相关（图2d）。分类学分析显示，大多数异化砷/铁还原基因由细菌携带，其中以地杆菌科、假赤潮菌科、伯克霍尔德氏菌科和厌氧黏球菌科为主导（图3b）。已知一些异化砷/铁还原细菌（如地杆菌属）能够将有机物氧化与Fe(III)和As(V)还原耦合。值得注意的是，此前未被关联到砷还原的Geoanaerobacter在夜间表现出较高的arrA转录本水平，提示其可能参与砷还原过程（图3b）。部分属（例如Methanogaster、Minicystis和Methanoperedens）则呈现出相反的日节律模式（图3a），这可能反映了不同代谢途径、氧化还原偏好或植物-微生物互作所塑造的生态策略差异。代表性基因的RT-qPCR验证结果证实了宏转录组数据的可靠性（图5a）。它们的昼夜转录动态凸显了影响水稻根际中砷/铁循环的不同微生物介导过程。
一项类比的田间实验证实，在温室盆栽实验中观察到的昼夜变化在真实野外条件下同样存在，而非受控温室环境造成的假象（图5e）。在夜间，arrA、omcS和mtrC的田间metT值显著升高，分别高出1.6倍、8.4倍和1.8倍（P < 0.05）。同样，Geobacter、Geotalea和Anaeromyxobacter等功能菌属的夜间metT值也显著升高，分别为4.9倍、3.5倍和2.7倍（P < 0.05）。这些结果表明，温室实验中观察到的昼夜表达模式与自然野外条件一致。
图2. 砷和铁相关功能基因的昼夜变异
图3. 携带异同化砷铁还原基因的功能类群的鉴定
3. As/Fe还原剂活性的根际氧化还原调控
多元变量和网络分析（图4）表明，根际砷的动态变化是由地球化学条件与微生物转录活性共同作用的结果。斯皮尔曼相关性分析显示，功能菌属与环境因子之间存在关联，包括Eh、As(III)、Fe(II)、pH和DOC（图4a）。随机森林分析进一步发现，Fe(II)和Eh是影响As(III)浓度的主要因素（图4b）。网络分析（图4c）还表明，根际微生物群落对氧化还原状态的变化具有动态响应，不同时间点由不同的分类群和功能基因主导。夜间Eh值下降会促进异养型砷/铁还原基因的转录，而白天则因根部释放的氧气抑制了这一过程。
在夜间无氧条件下，根际环境有利于异养型砷/铁还原菌的生长和代谢。这些细菌通过将五价砷(As(Ⅴ))还原为三价砷(As(III))，以及将三价铁(Fe(III))还原为二价铁(Fe(II))来产生能量。这些过程由细胞外电子传递系统介导，包括MtrC、OmcS和OmcZ蛋白，其编码基因在夜间表现出metaT水平升高（图2b）。mtrC和omcS基因表达增强促进了三价铁的还原，进而因含砷氧化铁水合物的还原溶解而释放并还原五价砷。这种生物地球化学耦合现象与夜间Fe(II)和As(III)浓度上升的现象一致（图1a），表明微生物酶活性在根际环境中调控着氧化还原驱动的元素循环。昼夜氧化还原波动由植物光周期驱动。白天，光合作用产生的氧气通过水稻根系输送到根际，维持约365 mV的电位，从而抑制异养型砷/铁还原菌的活性。夜间，光合作用的缺失导致氧气输入减少，形成低氧环境，从而激活这些细菌并促进三价铁(Fe(III))和五价砷(As(V))的还原。这种植物昼夜节律与微生物代谢之间的关联，还通过恒定黑暗实验得到了进一步验证。当植物被剥夺光照时，Eh电位持续下降至−180 mV，As(III)和Fe(II)的日变化周期被打乱，前两个周期出现相位偏移，并在第三天后持续升高（图5b,c）。在此条件下，功能基因的metaT值以及功能属的转录活性未表现出显著的日变化（图5d），证实了根部驱动的氧气通量对于维持砷/铁还原菌的节律性转录活性以及由此产生的日周期性砷-铁循环至关重要。
日间根系碳的分泌进一步加强了植物与微生物之间的耦合关系。根际孔隙水中的平均溶解性有机碳(DOC)浓度在白天增加了22.3%（图1a,b），这与光合作用活性增强一致，并且与多个功能菌属（例如Geoanaerobacter）的转录丰度呈正相关（图4a）。这些分泌物作为电子供体，在夜间即使光合作用停止时，仍可驱动异养型五价砷(As(V))和三价铁(Fe(III))的还原反应。这些碳化合物的积累及其随后的呼吸作用，解释了夜间氧气耗尽和电位(Eh)下降的现象，为根际还原过程的昼夜激活提供了机制基础。
图4. 根际孔隙水As(III)浓度日变化的相关因素
图5. 水稻根际微生物活性和土壤特性的验证
4. RNA观测微生物活性的昼夜节律
本研究采用RNA相关技术，深入揭示了微生物活性的时空调控机制，捕捉到了DNA检测方法可能无法发现的基因表达动态变化。尽管宏基因组测序未显示As/Fe还原基因丰度存在显著的日周期性变化（图2a），但通过qPCR验证结果证实了该结论，而转录组数据则显示出这些基因转录活性存在显著差异，尤其在夜间更为明显。这些发现对生物地球化学循环和环境健康等更广泛的环境过程具有重要意义。根际环境中Fe(III)和As(V)的还原作用，可能影响其他必需营养元素（如磷、硫和锰）的迁移性和生物可利用性。例如，Fe(III)的还原可促进生物可利用磷的释放，因为其常与土壤中的Fe(OH)₃结合。同样，硫酸盐还原为硫化物可降低多种有毒金属的迁移性，而异养锰还原则可能提高Mn(II)浓度，从而增强其被植物吸收的能力。此外，基于昼夜变化规律的氧化还原策略有助于减少水稻温室气体排放，对气候和土壤健康具有协同益处。这些过程不仅对植物营养至关重要，也对缓解金属污染带来的风险具有重要意义，尤其是在水稻土壤常处于波动氧化还原条件的农业系统中。
综上所述，本研究揭示了水稻根际环境中砷（As）和铁（Fe）循环的昼夜动态特征，重点关注微生物过程（图6）。夜间，电位（Eh）下降形成了还原性环境，促进了参与砷和铁还原的关键微生物群落（如Geoanaerobacter和Geobacter）的活性。这在arrA、omcS、omcZ和mtrC等基因的转录丰度增加中得到体现，尽管微生物种群在昼夜之间未表现出显著变化，凸显了RNA谱分析在评估动态生物地球化学循环过程中的重要性。恒定黑暗实验验证了氧化还原节律、微生物转录与砷/铁释放之间的关联。这些夜间过程促进了铁矿物的还原溶解，并增强了三价砷(As(III))的释放。研究结果表明，有必要将昼夜节律纳入采样策略，以捕捉根际环境中砷动态变化和微生物功能，从而为水稻管理提供实际应用价值，例如在清晨定期排水以去除溶解的三价砷，减少水稻根系对砷的吸收。此外，通过昼夜调控金属和养分循环，可优化农业管理措施，改善土壤健康、提升食品质量和安全性、减少温室气体排放以及降低污染物风险。未来的研究可利用合成微生物群落，探索微生物类群与其在元素循环中作用的关系。同时，考察植物不同发育阶段有助于判断昼夜砷和铁还原动力学是否与生长阶段相关。
图6. 水稻根际砷/铁含量波动